Czy cukrzyca przyspiesza starzenie naczyń? Nowe odkrycia naukowe

Czy cukrzyca przyspiesza starzenie naczyń?

Cukrzyca stanowi coraz większe wyzwanie dla systemów opieki zdrowotnej na całym świecie. Według danych Międzynarodowej Federacji Diabetologicznej i Światowej Organizacji Zdrowia, obecnie co dziesiąta osoba cierpi na cukrzycę, a prognozy wskazują, że do 2045 roku liczba chorych osiągnie 784 miliony. Głównym problemem jest nieodwracalność uszkodzeń wywołanych przez cukrzycę – obecnie możliwa jest jedynie prewencja powikłań, a nie ich całkowite wyeliminowanie.

Powikłania naczyniowe, takie jak nadciśnienie tętnicze, miażdżyca, choroba wieńcowa i udar mózgu, stanowią główną przyczynę zgonów u pacjentów z cukrzycą. O ile w populacji ogólnej schorzenia te rozwijają się zazwyczaj u osób w wieku około 70 lat, u diabetyków pojawiają się znacznie wcześniej – średnio około 55 roku życia. Badania naukowe wykazały, że cukrzyca przyspiesza procesy starzenia organizmu o około 15 lat, co tłumaczy zwiększone ryzyko chorób naczyniowych we wcześniejszym wieku.

Zjawisko to, określane jako “metaboliczne przedwczesne starzenie“, obejmuje zaburzenia kluczowych mechanizmów komórkowych, w tym autofagii, zwiększoną apoptozę, skracanie telomerów, dysfunkcję mitochondriów oraz senescencję komórkową. Równolegle dochodzi do przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez nadmierną proteolizę, co przyczynia się do degeneracji tkanki i dysfunkcji naczyń. Zmiany te przypominają procesy obserwowane podczas fizjologicznego starzenia, co wyjaśnia, dlaczego cukrzyca jest obecnie uważana za stan progeryczny, szczególnie w odniesieniu do układu naczyniowego. Wcześniejsze badania wykazały, że myszy db/db, poza hiperglikemią, rozwijają zmiany w ścianie aorty analogiczne do tych obserwowanych u starszych zwierząt niecukrzycowych, w tym fragmentację włókien elastycznych i sztywnienie, co potwierdza ich znaczenie jako modelu przyspieszonego starzenia naczyń.

Czy macierz zewnątrzkomórkowa jest kluczem do funkcjonalności naczyń?

W kontekście badań nad zapobieganiem naczyniowym powikłaniom cukrzycy, szczególnie istotne jest utrzymanie spójnej i funkcjonalnej architektury macierzy zewnątrzkomórkowej naczyń. Właściwości mechaniczne tej macierzy zależą od jej organizacji i składu. Wysoka zawartość kolagenu, odpowiedzialnego za wytrzymałość i sztywność, oraz elastyny, odpowiedzialnej za elastyczność i sprężystość, umożliwia tworzenie gęstej sieci włókien odpornej na rozciąganie. Elastyna jest szczególnie obecna w tkankach poddawanych obciążeniom mechanicznym, takich jak tętnice, skóra i płuca.

W ścianach naczyń krwionośnych wysoka proporcja kolagenu i elastyny pozwala dużym tętnicom (tzw. tętnicom elastycznym) na przeciwstawianie się rozciąganiu wywołanemu przez ciśnienie skurczowe oraz na wygładzanie nieciągłego przepływu krwi powodowanego przez pracę serca – zjawisko znane jako efekt Windkessela. Utrzymanie prawidłowej macierzy zewnątrzkomórkowej tętnic jest kluczowe dla ich funkcji i jest realizowane głównie przez fibroblasty i komórki mięśni gładkich, które mogą zarówno syntetyzować, jak i przebudowywać tę macierz.

Kolagen i elastyna są dwoma najobfitszymi i najdłużej utrzymującymi się składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej. W dużych tętnicach elastycznych elastyna jest składnikiem dominującym w porównaniu z kolagenem. W macierzy zewnątrzkomórkowej elastyna, której ekspresja jest regulowana przez oś IGFRI-FOXO, organizuje się w włókna elastyczne. Włókna te są złożonym zespołem rdzenia elastynowego otoczonego mikrofibrylami ułożonymi w koncentryczne blaszki elastyczne w ścianie dużych tętnic elastycznych. Mikrofibryle składają się z fibryliny (1, 2 i 3), glikoprotein związanych z mikrofibrylami (MAGP), białka wiążącego latentny transformujący czynnik wzrostu beta (LTBP), fibulin i emiliny-1. Składniki mikrofibrylarnej, wraz z enzymami sieciującymi oksydazą lizylową (LOX) i oksydazą lizylową podobną do 1 do 4 (LOXL1, -2, -3, -4), które tworzą mostki desmozynowo-izodesmozynowe wewnątrz włókien, ułatwiają organizację monomerów tropoelastyny podczas procesu dojrzewania elastyny i są również zaangażowane w interakcje komórka-włókno elastyczne.

Elastyna jest wyjątkowo trwałym białkiem o okresie półtrwania szacowanym na 70 lat. Szczyt jej syntezy przypada na okres okołoporodowy i kończy się wraz z zakończeniem dzieciństwa. U dorosłych elastogeneza jest praktycznie nieobecna. Dlatego od okresu dojrzewania obserwuje się powolną i postępującą degradację włókien elastycznych, co wpływa na ich funkcje. Proces ten jest centralnym elementem starzenia się naczyń.

W warunkach fizjologicznych lub patologicznych wywołujących stan zapalny, elastazy przyczyniają się do degradacji elastyny. Metaloproteinaza-2 (MMP-2, żelatynaza A), -9 (MMP-9, żelatynaza B), -7 (MMP-7, matrylizyna) i -12 (MMP-12, elastaza makrofagowa) są silnymi elastazami. Wydzielanie elastaz leukocytowych oraz katepsyn S i G podczas procesów zapalnych również prowadzi do zwiększonej degradacji elastyny. Ostatnio ustalono również związek między insulinoopornością a ekspresją elastazy neutrofilowej lub katepsyny S, co pogarsza fragmentację elastyny.

Aktywność proteaz takich jak katepsyna S, elastaza neutrofilowa, MMP-9 może być regulowana przez specyficzne naturalne inhibitory, takie jak inhibitory proteaz serynowych (serpiny), cystatyna C, TIMP-1. Inhibitory te, syntetyzowane i wydzielane przez liczne komórki, występują obficie we wszystkich płynach ustrojowych i pomagają zapobiegać zdarzeniom miażdżycowym, tętniakom i nadciśnieniu. Jednak ekspresja tych samych inhibitorów jest dramatycznie zmniejszona podczas zespołu metabolicznego, co sprzyja aktywności elastaz.

W związku z powyższym, zachowanie integralności macierzy zewnątrzkomórkowej, a w szczególności ochrona włókien elastycznych przed elastazami, jest niezbędne do utrzymania funkcji tętnic. Postawiono hipotezę, że stymulacja elastogenezy i hamowanie elastolizy mogą zmniejszyć wywołane cukrzycą starzenie się włókien elastycznych, podobne do tego, co zaobserwowano wcześniej.

Elastogeneza to proces, który ustaje w okresie dojrzewania. U dorosłych można ją wywołać jedynie poprzez wprowadzenie egzogennych cząsteczek. Obecnie leczenie minoksydylem jest jedynym opisanym jako zdolne do indukowania neosyntezy funkcjonalnych włókien elastycznych u ludzi i w kilku modelach mysich, w tym u starych myszy lub myszy z niedoborem elastyny. Minoksydyl jest opisywany jako otwieracz kanałów potasowych, co sugeruje, że synteza włókien elastycznych de novo może być pod kontrolą kanałów potasowych. Jednak minoksydyl ma znaczące skutki uboczne. Dlatego kluczowe jest testowanie innych leków przeciwnadciśnieniowych.

Wiele leków przeciwnadciśnieniowych, ukierunkowanych na przykład na angiotensynę, wywiera również znaczący wpływ metaboliczny. Z tego powodu priorytetowo potraktowano cząsteczki beta-blokujące i przetestowano nebiwolol, który miałby znikomy wpływ metaboliczny, jednocześnie potencjalnie oddziałując na kanały potasowe. Ponadto nebiwolol został opisany jako inhibitor zwłóknienia serca, wykazując w ten sposób znaczący wpływ na macierz zewnątrzkomórkową serca i sugerując potencjalnie rolę w przebudowie naczyniowej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Jak przebiega badanie in vivo oraz pomiar efektów terapeutycznych?

W prezentowanym badaniu oceniono zdolność dwóch cząsteczek przeciwnadciśnieniowych, nebiwololu (beta-blokera) i minoksydylu, do zmiany równowagi elastogenezy-elastolizy w kierunku neosyntezy włókien elastycznych w modelu myszy cukrzycowych, które nie wykazywały ekspresji receptora leptyny (db/db). Minoksydyl jest znanym otwieraczem kanałów K+ATP, który indukuje neo-elastogenezę w modelach starzenia lub niedoboru elastyny. Jednak jego znane działania niepożądane ze strony układu sercowo-naczyniowego ograniczają jego długotrwałe stosowanie w warunkach klinicznych.

Nebiwolol, beta-bloker z właściwościami agonisty receptora β3 i działaniem rozszerzającym naczynia za pośrednictwem tlenku azotu (NO), wykazał działanie antyoksydacyjne i ochronne na śródbłonek. Cechy te są szczególnie istotne w kontekście cukrzycy, która charakteryzuje się przewlekłym stresem oksydacyjnym i dysfunkcją śródbłonka. Oba środki wykazały korzystne działanie na przebudowę naczyń i sztywność, które są charakterystycznymi cechami waskulopatii cukrzycowej.

W badaniu wykorzystano samce myszy db/db (C57BL6/J jako tło genetyczne) w wieku 6 miesięcy, aby przetestować leczenie na ciężkim modelu cukrzycowym prezentującym znaczące zmiany sercowo-naczyniowe, zgodnie z literaturą. Jako grupę referencyjną wykorzystano 6-miesięczne niecukrzycowe myszy kontrolne (C56BL6/J). Wszystkie myszy miały dostęp ad libitum do standardowej diety i wody w okresie eksperymentalnym. Woda pitna (odnawiana codziennie) myszy db/db zawierała (lub nie) minoksydyl (20 mg/kg/dzień) lub nebiwolol (20 mg/kg/dzień) przez 8 tygodni. Stężenia i czasy leczenia zostały dostosowane do wcześniejszych danych z literatury wykorzystujących minoksydyl jako cząsteczkę terapeutyczną w przypadku zmian macierzy zewnątrzkomórkowej.

Czy minoksydyl przywraca elastyczność aorty?

Parametry fizjologiczne, takie jak ciśnienie krwi, prędkość fali tętna i analiza ultrasonograficzna wysokiej częstotliwości, zostały szczegółowo ocenione. Pomiar ciśnienia krwi przeprowadzono po wstępnym kondycjonowaniu w ciągu 7 dni przed końcowym pomiarem. Pomiar prędkości fali tętna przeprowadzono nieinwazyjnie za pomocą ultradźwiękowego systemu Dopplera przepływu prędkości na znieczulonych myszach. Analizę ultrasonograficzną wysokiej częstotliwości przeprowadzono za pomocą systemów obrazowania Vevo pod lekkim znieczuleniem izofluranem, zgodnie z wytycznymi etycznymi i w celu zminimalizowania depresji sercowo-naczyniowej u myszy db/db.

W badaniu zidentyfikowano również zaangażowane cele molekularne tych związków jako wstępny krok do opracowania skutecznych strategii terapeutycznych mających na celu ograniczenie naczyniowych powikłań cukrzycy w tym modelu zwierzęcym.

Wyniki badania wykazały, że leczenie minoksydylem zmniejsza sztywnienie aorty u myszy cukrzycowych. Minoksydyl obniżył ciśnienie skurczowe i tętnicze (ale nie średnie ciśnienie tętnicze), a także prędkość fali tętna aorty lub podatność i rozszerzalność mierzone metodą ultrasonografii, wskazujące na sztywność tętnic. Wiązało się to ze zmniejszeniem ekspresji markerów skurczu komórek mięśni gładkich (SMC): α-SMA, SM-22α, MLCK (kinaza łańcuchów lekkich miozyny), kalponiny i MYH11 (łańcuch ciężki miozyny mięśni gładkich).

Dane te wykazały skuteczność przeciwnadciśnieniową i przeciwsztywnieniową aorty minoksydylu u zwierząt cukrzycowych, jednak nie wpłynęły na parametry glikemiczne. Podawanie minoksydylu może być wystarczające do przywrócenia prawie normalnej funkcji aorty. Minoksydyl indukował również przebudowę ściany aorty, prowadząc do zmniejszenia grubości błony wewnętrznej-środkowej i przydanki. Jest to prawdopodobnie spowodowane zmniejszeniem całkowitej zawartości kolagenu w ścianie, szczególnie kolagenu typu III i I, co zaobserwowano za pomocą barwienia czerwienią pikrosiriusową.

Jak nebiwolol wpływa na strukturę naczyń i proteolizę?

Wzrost ekspresji mRNA tych kolagenów wraz z brakiem zwiększonej całkowitej zawartości kolagenu i wiązań krzyżowych sugeruje degradację nowo zsyntetyzowanych kolagenów. Ponieważ przewlekły stan zapalny, poprzez produkcję cytokin takich jak TNF-α i IL-6, może promować zwłóknienie tkanki, sprawdzono, czy leczenie minoksydylem wpływa na czynniki zapalne, które mogłyby wyjaśnić zmiany w ekspresji kolagenu. Stwierdzono, że minoksydyl znacząco zmniejsza produkcję cytokin pro-fibrotycznych zarówno na poziomie osocza, jak i w aorcie myszy db/db.

Leczenie minoksydylem promuje elastogenezę, jednocześnie zmniejszając elastolizę u myszy cukrzycowych. Poziom autofluorescencji elastyny i ilość elastyny są zwiększone, co sugeruje wzrost zawartości włókien elastycznych i/lub zmniejszenie degradacji włókien elastycznych po leczeniu minoksydylem, jak pokazano przez autofluorescencję elastyny i barwienie Harta. Ponadto, podczas gdy liczba blaszek elastycznych pozostała niezmieniona po leczeniu minoksydylem, liczba przerwań blaszek elastycznych zmniejszyła się, co odzwierciedla restrukturyzację blaszek.

Ta zmniejszona fragmentacja sieci elastycznych jest potwierdzona przez znaczący spadek poziomu peptydów pochodnych elastyny (EDP) i desmozyny w osoczu. W odniesieniu do elastolizy, aktywność katepsyny S i elastazy neutrofilowej została zmniejszona przez leczenie, podczas gdy poziomy mRNA proteaz tkankowych nie zostały zmienione przez minoksydyl. Wywołane minoksydylem zmniejszenie elastolizy w aorcie zostało wzmocnione przez stymulujący wpływ leczenia na zwiększoną ekspresję tkankową naturalnego inhibitora proteaz, takiego jak inhibitor peptydazy serynowej (SERPIN).

Czy modulacja insulinooporności wspiera elastogenezę w komórkach SMC?

Fakt, że leczenie minoksydylem stymulowało elastogenezę aorty, jest dodatkowo sugerowany przez podwyższone poziomy mRNA dla elastyny, LTBP4 i LOXL1. Zwiększona i efektywna elastogeneza została wykazana przez wzrost wiązań krzyżowych po leczeniu, ponieważ występowanie tych wiązań krzyżowych jest wskaźnikiem dojrzałości i funkcjonalności włókien elastycznych.

Hamowanie elastolizy i indukcja elastogenezy przez minoksydyl poprawiły zawartość i funkcję włókien elastycznych, na co wskazuje zmniejszenie sztywności blaszek elastycznych i przestrzeni międzyblaszkowych u myszy cukrzycowych, co potwierdzono pomiarami za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). Obserwacje te pokazują, że minoksydyl ogranicza przedwczesne starzenie się ściany aorty u myszy cukrzycowych i częściowo przywraca funkcję aorty.

Dane dotyczące parametrów sercowych pokazują jednak, że po podaniu minoksydylu objętość wyrzutowa serca i końcowo-rozkurczowa objętość lewej komory wzrosły u myszy db/db. Dane te podkreślają fakt, że problemy związane z zaburzeniami funkcji lewej komory (LV) mogą ostatecznie wpłynąć na funkcję i strukturę aorty w czasie. Może to zagrozić przeciwstarzeniowym działaniu naczyniowemu leków stosowanych w badaniu i innych.

Przewlekłe leczenie nebiwololem ogranicza postęp sztywności aorty wywołanej cukrzycą. Przewlekle leczenie minoksydylem może kompensować elastolizę wywołaną cukrzycą. Jednak leczenie to ma kilka skutków ubocznych dla funkcji serca, które ograniczają jego zastosowanie. Z tego powodu postanowiono przetestować inne cząsteczki przeciwnadciśnieniowe, które mogłyby mieć podobne korzystne efekty bez tych szkodliwych skutków ubocznych.

Jak otwieracze kanałów potasowych regulują elastogenezę przez FOXO?

Wśród cząsteczek przeciwnadciśnieniowych farmakologiczna blokada receptora β1-adrenergicznego może wydłużyć życie myszy i muszek owocowych, niezależnie od masy ciała lub zespołu metabolicznego. Dlatego wybrano ocenę wpływu nebiwololu, który został opisany jako beta-bloker zmniejszający częstość akcji serca i silny wazodylator aktywujący receptory adrenergiczne β2 w komórkach śródbłonka i komórkach mięśni gładkich.

Wykazano, że leczenie nebiwololem przez 8 tygodni jest wystarczające do zmniejszenia ciśnienia skurczowego, średniego i tętniczego. Zaobserwowano również wywołane nebiwololem zmniejszenie prędkości fali tętna aorty, co sprzyja podatności aorty piersiowej i zmniejsza moduł Younga, a także ekspresję czynników zwężających naczynia, takich jak SM-22α, α-SMA, MLCK, kalponina i Myh11. Co ciekawe, nebiwolol przywraca funkcje aorty do poziomów obserwowanych u młodych, niecukrzycowych myszy.

Z anatomicznego punktu widzenia leczenie nebiwololem również znacząco zmniejszyło grubość przydanki i błony wewnętrznej-środkowej. Co ważne, modyfikacje kolagenu nie mogą same w sobie wyjaśnić zmniejszenia grubości po leczeniu. Ekspresja mRNA typów I i III była znacząco zwiększona, podczas gdy barwienie kolagenu czerwienią pikrosiriusową w przydance aorty było zmniejszone. Ponadto całkowity poziom kolagenu i ilość wiązań krzyżowych były porównywalne do obserwowanych u nieleczonych myszy db/db.

Podobnie jak minoksydyl, leczenie nebiwololem wywołuje zmniejszenie pro-fibrotycznych czynników zapalnych w aorcie myszy cukrzycowych, a także w ich osoczu w porównaniu do nieleczonych myszy db/db. Za pomocą Western blottingu, autofluorescencji elastyny i ekstrakcji nierozpuszczalnej elastyny wykazano wzrost ilości elastyny po leczeniu nebiwololem.

Czy przywrócenie homeostazy macierzy zewnątrzkomórkowej spowalnia przedwczesne starzenie naczyń?

Za pomocą barwienia Harta lub przez autofluorescencję elastyny zaobserwowano, że chociaż liczba blaszek elastycznych nie zmieniła się w błonie środkowej, ich integralność została poprawiona przez leczenie nebiwololem. Świadczy o tym dramatyczny spadek przerwań blaszek elastycznych i zmniejszony poziom EDP i desmozyny w osoczu. Równolegle leczenie nebiwololem zmniejszyło aktywność katepsyny S i elastazy neutrofilowej w osoczu, podczas gdy, co zaskakujące, ekspresja katepsyny S w aorcie była zwiększona.

Ekspresja naturalnych inhibitorów elastaz MMP9 i elastazy neutrofilowej, czyli TIMP1 i SERPIN, była znacząco zwiększona przez leczenie nebiwololem. Leczenie nebiwololem indukowało również ekspresję elastyny i LOXL1 oraz zmniejszało ekspresję LOXL3, co sugeruje pozytywny wpływ na elastogenezę. Ta neosynteza elastyny była związana ze wzrostem wszystkich klas wiązań krzyżowych, co sugeruje tworzenie dojrzałej i funkcjonalnej elastyny.

Konsekwencją leczenia był spektakularny spadek sztywności aorty (5-10 razy), mierzony za pomocą AFM. Wszystkie te ustalenia sugerują, że przewlekłe leczenie nebiwololem może ograniczyć przedwczesne starzenie się włókien elastycznych, z mniejszymi działaniami niepożądanymi ze strony układu sercowo-naczyniowego.

Badania in vitro wykazały, że minoksydyl i nebiwolol stymulują elastogenezę i ograniczają elastolizę w hodowanych naczyniowych komórkach mięśni gładkich. Jak opisano w literaturze, cukrzyca promuje in vivo procesy skurczu mięśni gładkich naczyń i ekspresję markerów elastolizy. Natomiast zastosowanie cząsteczek przeciwnadciśnieniowych minoksydylu lub nebiwololu u zwierząt cukrzycowych indukowało zmniejszenie markerów skurczu komórek mięśni gładkich i zwiększenie markerów elastogenezy.

W tym kontekście celem było skupienie się na wpływie leczenia, minoksydylu i nebiwololu, na zachowanie insulinoopornych komórek mięśni gładkich (SMC). W tym celu SMC były preinkubowane w medium wzbogaconym glukozą-palmitynianem. Aby zachować spójność między modelami in vivo (samce myszy db/db ze szczepu C57/Bl6J) i warunkami in vitro, zdecydowano się wykorzystać linię komórkową MOVAS, pochodzącą z komórek mięśni gładkich samców myszy C57Bl6J.

Podobnie jak komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich odgrywają kluczową rolę w zachowaniu homeostazy macierzy zewnątrzkomórkowej. Insulina została użyta jako kontrola pozytywna mająca zdolność indukowania hiperpolaryzacji błon komórek mięśni gładkich. Leczenie glukozą-palmitynianem zmniejszyło poziomy fosforylacji receptora insuliny i powiązanych aktorów ścieżki, Akt i czynnika transkrypcyjnego FOXO1.

Warunek palmitynian-glukoza również zmniejsza wychwyt glukozy i zwiększa ekspresję mRNA PEPCK, znaną jako będącą pod kontrolą aktywności FOXO1. Razem dane te sugerowały, że warunek palmitynian-glukoza indukował insulinooporność w komórkach MOVAS.

Warunek glukoza-palmitynian znacząco zwiększył ekspresję α-SMA, MLCK, kalponiny i Myh11, podczas gdy w połączeniu z insuliną, minoksydylem lub nebiwololem zaobserwowano zmniejszenie jej ekspresji, zbliżając się do ekspresji samej insuliny (w przypadku braku insulinooporności). Sugeruje to, że insulinooporność in vitro może sprzyjać skurczowi linii komórkowej MOVAS, izolowanej z mięśni gładkich dorosłej myszy, poprzez zmianę poziomów kilku genów zaangażowanych w skurcz.

Co ciekawe, te ekspresje “genów kurczliwych” są związane ze wzrostem pro-zapalnych cytokin (TNFα, IL6 lub IL1b) w warunkach insulinooporności, podczas gdy obecność minoksydylu lub nebiwololu znacząco zmniejsza ekspresję IL6 i IL1b.

Wykazano, że insulina stymuluje ekspresję mRNA markerów elastogenezy (elastyny, fibryliny 1, fibuliny 5, LTBP4 i LOXL1) i produkcję elastyny. Odwrotnie, indukcja insulinooporności (pomimo obecności insuliny) nie podnosi ekspresji tych samych markerów lub nawet zmniejsza ich ekspresje, z możliwym wyjątkiem LTBP4. Dodanie minoksydylu lub nebiwololu w obecności glukozy-palmitynianu zwiększa poziomy mRNA i białka wszystkich markerów elastogenezy z wyjątkiem LOXL1.

Sama insulina nie ma wpływu na markery elastolizy, MMP-9 i katepsynę S. Insulinooporność wywołana glukozą-palmitynianem znacząco zwiększyła ekspresję obu elastaz, a efekt ten został zniesiony przez minoksydyl lub nebiwolol. Co zaskakujące, minoksydyl i nebiwolol również zmniejszyły ekspresję naturalnego inhibitora MMP-9, TIMP1.

Gdy porównano stosunek ekspresji elastazy do jej naturalnego inhibitora (tj. MMP9/TIMP1 i katepsyna S/cystatyna C), zaobserwowano, że insulinooporność zwiększyła stosunek katepsyny S/cystatyny C, a efekt ten został zniesiony przez insulinę, minoksydyl i nebiwolol. Odwrotnie, glukoza-palmitynian zmniejszyła stosunek MMP9/TIMP1, a ani insulina, minoksydyl, ani nebiwolol nie mogły zmodyfikować tego efektu.

Dane te sugerują, że insulinooporność promuje skurcz komórek MOVAS i sprzyja elastolizie, podczas gdy środki relaksujące mięśnie gładkie, takie jak insulina, minoksydyl i nebiwolol, są czynnikami pro-elastogenicznymi. W badaniach korelacji przeprowadzonych na myszach db/db leczonych minoksydylem i nebiwololem zaobserwowano negatywną korelację między markerami skurczu (αSMA i SM22) a czynnikami elastogenicznymi (elastyną i LOXL1).

Leczenie minoksydylem i nebiwololem otwiera kanały potasowe w hodowanych naczyniowych komórkach mięśni gładkich. Minoksydyl został opisany jako otwieracz kanału potasowego, który hiperpolaryzuje błony komórkowe, powodując rozluźnienie mięśni naczyniowych i w konsekwencji zwiększenie przepływu krwi. Działanie rozszerzające naczynia nebiwololu przypisywano głównie mechanizmom zależnym od śródbłonka, w tym receptorom beta-adrenergicznym. Jednak nebiwolol ma dodatkowe właściwości rozszerzające naczynia.

Tak więc zaangażowanie wrażliwych na ATP kanałów potasowych (KATP) komórek mięśni gładkich byłoby drugim mechanizmem zaangażowanym w odpowiedź rozszerzającą naczynia na nebiwolol. Nebiwolol może pośrednio działać na kanał, zmniejszając stężenia ATP w cytoplazmie poprzez hamowanie mitochondrialnej syntazy ATP i/lub zwiększenie odpływu ATP na zewnątrz komórki.

Otwieranie kanałów potasowych przez minoksydyl lub nebiwolol może być związane z indukcją elastogenezy i hamowaniem elastolizy. W przeciwieństwie do tego, zamknięcie bramkowanych napięciem kanałów potasowych przez tetraetyloamonium (TEA) lub kanału KATP przez glibenklamid jest związane ze zmniejszeniem większości markerów (białkowych lub transkryptów) elastogenezy, podczas gdy markery elastolizy są wyrażone.

Aby ustalić, czy status kurczliwy komórek MOVAS jest czynnikiem determinującym, wywołano depolaryzację błony komórek przez dodanie KCl do pożywki hodowlanej. Przed badaniem oceniono cytotoksyczny wpływ dodania zewnątrzkomórkowego KCl na przeżycie komórek MOVAS. Nadmiar zewnątrzkomórkowego potasu skutecznie indukuje skurcz komórek, ale nie wydaje się mieć istotnego wpływu na elastogenezę i elastolizę.

Z drugiej strony, obecność KCl (lub glibenklamidu) hamuje wpływ minoksydylu lub nebiwololu na ekspresję transkryptów lub białek, takich jak elastyna. Razem wyniki te sugerują, że konfiguracja kanałów potasowych (otwartych lub zamkniętych) jest głównym elementem kontroli równowagi elastogenezy-elastolizy. Dlatego ważne jest określenie ścieżki sygnałowej łączącej kanał potasowy i ekspresję transkryptów. Kilka badań sugerowało, że zmniejszenie funkcji kanału KATP prowadzi do represji FOXO-1.

Leczenie minoksydylem i nebiwololem hamuje czynnik transkrypcyjny FOXO w hodowanych naczyniowych komórkach mięśni gładkich. Postawiono hipotezę, że ścieżka kanału KATP mogłaby aktywować czynnik transkrypcyjny FOXO1, zaangażowany w przedwczesne starzenie. Co ciekawe, dane z literatury sugerują, że ścieżki sygnałowe insuliny modulują aktywność FOXO1, zgodnie z wynikami dotyczącymi ścieżki sygnałowej insuliny.

Ponadto wykazano, że zmiany w ekspresji elastyny następują po zmianach w ekspresji i fosforylacji FOXO1 w zależności od tego, czy komórki mięśni gładkich są insulinooporne, czy nie, lub leczone minoksydylem lub nebiwololem, czy nie. Zwiększona fosforylacja FOXO związana z ekspresją elastyny była również obserwowana w aortach myszy db/db leczonych minoksydylem lub nebiwololem.

Początkowo przeprowadzono badanie transkryptomiczne FOXO1 i FOXO3 na komórkach MOVAS inkubowanych w różnych mediach, stymulujących otwieranie lub zamykanie kanałów potasowych wrażliwych na ATP. W komórkach inkubowanych w klasycznym medium (DMEM) obecność otwieraczy kanału KATP minoksydylu i nebiwololu drastycznie zmniejszyła ekspresję FOXO1 i, tylko w przypadku nebiwololu, FOXO3.

Odwrotnie, trzy warunki zamykania kanałów KATP (medium hodowlane z glibenklamidem, KCl lub glukozą-palmitynianem) znacząco zwiększyły ekspresję FOXO1, podczas gdy tylko KCl i glukoza-palmitynian podwyższyły poziomy mRNA FOXO3. Medium hodowlane uzupełnione KCl lub glukozą-palmitynianem, minoksydyl lub nebiwolol spowodowały znaczące zmniejszenie ekspresji FOXO1 i FOXO3 w porównaniu do samej glukozy-palmitynianu lub KCl, podczas gdy zmniejszyły ekspresję FOXO1 i zwiększyły ekspresję FOXO3 w obecności glibenklamidu w porównaniu do samej glukozy-palmitynianu lub KCl.

Co ciekawe, FOXO1 został opisany jako potencjalny regulator elastyny i ekspresji MMP-9. Dlatego, aby potwierdzić wpływ FOXO1 na ekspresję ELN i MMP-9, użyto inhibitora transkrypcji FOXO1 AS1842856. Hamowanie aktywności FOXO1 przez AS1842856 w warunkach insulinooporności (palmitynian + glukoza) zwiększyło ekspresję elastyny i zmniejszyło ekspresję MMP-9 w porównaniu do samego palmitynianu i glukozy.

Zaobserwowano podobne efekty AS1842856 na ekspresję elastyny i MMP-9 w medium hodowlanym uzupełnionym glibenklamidem (lub KCl) w porównaniu do samego glibenklamidu lub KCl. Zaskakująco, w warunkach, w których kanały KATP były otwarte przez minoksydyl lub w obecności nebiwololu, inhibitor FOXO1 AS1842856 zmniejszał ekspresję MMP-9 i elastyny.

Czy przywrócenie homeostazy macierzy zewnątrzkomórkowej spowalnia przedwczesne starzenie naczyń?

Badanie pokazuje, że przywrócenie aktywności kanałów potasowych poprzez minoksydyl lub nebiwolol znacząco poprawia strukturę i funkcję ściany aorty u myszy cukrzycowych. Leczenie to odwróciło kluczowe cechy waskulopatii cukrzycowej, w tym degradację elastyny, akumulację kolagenu, zaburzenie równowagi proteolitycznej i sztywność naczyń. W insulinoopornych komórkach mięśni gładkich oba związki zwiększyły syntezę elastyny i aktywację FOXO1, sugerując wspólną ścieżkę obejmującą zależną od potasu regulację aktywności transkrypcyjnej.

Wyniki te są zgodne z koncepcją, że cukrzyca i otyłość indukują przyspieszone starzenie naczyń, które przejawia się głównie jako degradacja macierzy zewnątrzkomórkowej i sztywność tętnic. To przedwczesne starzenie przyczynia się do zmienionych mechanicznych zachowań naczyń (np. zmniejszona podatność, zwiększona prędkość fali tętna) i upośledza kurczliwość komórek mięśni gładkich, przyczyniając się do długoterminowej dysfunkcji naczyń. Dane te podkreślają znaczenie zachowania homeostazy macierzy zewnątrzkomórkowej w celu złagodzenia zarówno strukturalnego, jak i funkcjonalnego spadku.

Podczas gdy wiele klas leków przeciwnadciśnieniowych (inhibitory ACE, ARB, blokery kanałów wapniowych) zapewnia korzyści hemodynamiczne, ich wpływ na strukturę naczyń – szczególnie homeostazę włókien elastycznych – jest ograniczony lub pośredni. Wcześniejsze badania wykazały, że tylko niektóre klasy leków, takie jak agoniści β3 lub otwieracze kanałów K_ATP, wywierają korzystny wpływ na przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej. Minoksydyl, choć silny, jest ograniczony przez ogólnoustrojowe skutki uboczne.

Wyniki mechanistyczne sugerują, że oba leki promują elastogenezę poprzez aktywację FOXO1, czynnika transkrypcyjnego związanego z homeostazą metaboliczną i redoksową. Modulatory kanałów potasowych (minoksydyl, nebiwolol) utrzymywały aktywację FOXO1 w warunkach insulinooporności i wysokiego stężenia glukozy/wysokiego stężenia tłuszczu. Farmakologiczne hamowanie FOXO1 znosiło ten efekt. Chociaż nie przeprowadzono bezpośrednich pomiarów elektrofizjologicznych (np. patch-clamp), zastosowanie modulatorów, takich jak KCl i glibenklamid, potwierdza zaangażowanie kanałów K_ATP i bramkowanych napięciem kanałów K+.

Co ważne, wyniki sugerują również, że minoksydyl i nebiwolol mogą łagodzić starzenie się naczyń. Zaobserwowano zmniejszoną ekspresję markerów SASP (IL-6, IL-1β), wraz ze zmniejszoną ekspresją proteazy (elastaza neutrofilowa, katepsyna S) i zwiększoną ekspresją ich naturalnych inhibitorów (TIMP1, SERPIN). Te zmiany molekularne, związane z poprawą integralności macierzy zewnątrzkomórkowej, silnie sugerują efekt anty-starzeniowy, zgodny z wcześniejszym raportem o obecności starzenia się naczyń u myszy db/db.

Ponadto, kilka badań sugeruje, że członkowie rodziny FOXO odgrywają główną rolę w długowieczności poprzez zwiększenie ekspresji genów zaangażowanych w aktywność obronną przeciwko stresowi, metabolizm i zatrzymanie cyklu komórkowego.

Badanie ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, nie przeprowadzono rejestracji elektrofizjologicznych, co uniemożliwiło bezpośrednie potwierdzenie modulacji kanałów jonowych. Po drugie, użyto tylko samców myszy, co ogranicza wnioski dotyczące potencjalnych odpowiedzi specyficznych dla płci. Po trzecie, projekt badania był przekrojowy i nie oceniał długoterminowych lub odwracalnych efektów. Niemniej jednak, spójność między wynikami in vivo i in vitro potwierdza solidność zaobserwowanych mechanizmów.

Z perspektywy translacyjnej, ukierunkowanie na FOXO1 poprzez modulatory upstream stanowi atrakcyjną strategię walki z waskulopatią cukrzycową. Czynniki transkrypcyjne, takie jak FOXO1, są klasycznie trudne do bezpośredniego ukierunkowania, ale modulowanie kanałów potasowych oferuje realną alternatywę. Dane w literaturze sugerują, że ścieżka sygnałowa kanału potasowego wrażliwego na ATP obejmuje czynniki transkrypcyjne FOXO1, FOXO3. Ponadto, agoniści β-adrenergiczni mogą zwiększyć ekspresję i/lub aktywność członków rodziny FKHR, podczas gdy ten sam czynnik kontroluje ekspresję elastyny. Dlatego profil bezpieczeństwa nebiwololu i korzyści dla śródbłonka mogą uczynić go szczególnie obiecującym kandydatem do zastosowania klinicznego.

Dalsze badania u pacjentów z cukrzycą lub tkanki naczyniowej od ludzkich dawców będą niezbędne do potwierdzenia tych powiązań mechanistycznych i ich potencjału terapeutycznego. Kontrola ekspresji czynnika transkrypcyjnego FOXO byłaby zatem interesującą alternatywną celą terapeutyczną, aby zapobiec fizjologicznemu lub przedwczesnemu starzeniu się, obserwowanemu w cukrzycy i/lub otyłości.

Poza podstawowymi mechanizmami i efektami terapeutycznymi opisanymi powyżej, kilka dodatkowych kwestii zasługuje na omówienie. Oprócz mechanicznych i strukturalnych ulepszeń w ścianie aorty, oba leczenia znacząco modulowały zapalenie i ścieżki degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej. Zaobserwowano zmniejszenie cytokin związanych z SASP (np. IL-6, IL-1β), a także zmniejszoną aktywność enzymów elastolitycznych (np. elastaza neutrofilowa, katepsyna S), równolegle ze wzrostem ich endogennych inhibitorów (np. TIMP1, SERPIN). Te zmiany, wraz z przywróconą architekturą macierzy zewnątrzkomórkowej, sugerują, że zarówno minoksydyl, jak i nebiwolol mogą wywierać anty-starzeniowe działanie naczyniowe.

Chociaż nie oceniano bezpośrednio starzenia za pomocą SA-β-gal lub ekspresji p16/p21, obniżenie regulacji składników SASP potwierdza zmniejszenie obciążenia starzeniem się. Uzupełnia to wcześniejsze doniesienia, że waskulopatia cukrzycowa jest napędzana nie tylko przez degradację macierzy zewnątrzkomórkowej, ale także przez przewlekły stan zapalny o niskim stopniu i przedwczesne starzenie się komórek.

Jednak badanie było ograniczone do samców myszy db/db, a różnice specyficzne dla płci w starzeniu się naczyń, zapaleniu i odpowiedzi metabolicznej były szeroko zgłaszane. Na przykład, sygnalizacja estrogenowa wpływa na fenotyp SMC i syntezę macierzy zewnątrzkomórkowej, a samice mogą wykazywać opóźnione lub odrębne wzorce przebudowy naczyń w cukrzycy. Brak danych dotyczących samic ogranicza ekstrapolację na szerszą populację cukrzycową. Przyszłe badania u obu płci są niezbędne do oceny, czy obserwowana oś FOXO1-K+ i efekty leczenia są zachowane w różnych kontekstach biologicznych.

Wreszcie, podczas gdy wyniki identyfikują FOXO1 jako obiecujący węzeł regulacyjny w starzeniu się naczyń, jego bezpośrednie ukierunkowanie pozostaje wyzwaniem ze względu na jego charakter czynnika transkrypcyjnego, co komplikuje farmakologiczne hamowanie lub aktywację. Efekty poza celem, dynamika lokalizacji jądrowej i crosstalk ścieżek również stanowią przeszkody dla translacji klinicznej. Jednak użycie modulatorów upstream – takich jak otwieracze kanałów potasowych lub agoniści β3 – zapewnia pośrednią i potencjalnie bezpieczniejszą drogę. Nebiwolol, już w użyciu klinicznym, stanowi realnego kandydata z ustalonymi danymi dotyczącymi bezpieczeństwa, chociaż potrzebne są dalsze badania w celu oceny jego długoterminowego wpływu na punkty końcowe starzenia się naczyń u pacjentów z cukrzycą.

Podsumowanie

Cukrzyca powoduje przedwczesne starzenie naczyń krwionośnych, przyspieszając ten proces średnio o 15 lat. Prowadzi to do wcześniejszego występowania powikłań naczyniowych, takich jak nadciśnienie tętnicze, miażdżyca czy choroba wieńcowa. Badania wykazały, że leki przeciwnadciśnieniowe – minoksydyl i nebiwolol – mogą spowalniać ten proces poprzez wpływ na macierz zewnątrzkomórkową naczyń. Działają one poprzez stymulację elastogenezy (tworzenia nowych włókien elastycznych) oraz hamowanie elastolizy (degradacji elastyny). Mechanizm ich działania opiera się na regulacji kanałów potasowych i modulacji czynnika transkrypcyjnego FOXO1. Nebiwolol okazał się szczególnie obiecujący ze względu na mniejszą liczbę działań niepożądanych w porównaniu do minoksydylu. Wyniki badań sugerują, że przywrócenie homeostazy macierzy zewnątrzkomórkowej naczyń może być skuteczną strategią w zapobieganiu powikłaniom naczyniowym cukrzycy.